防治蓝莓棒状拟盘多毛孢菌化学药剂的室内筛选
摘要：为明确山东省蓝莓叶斑病和根腐病病原菌种类并筛选有效防治药剂，采用组织分离法获得菌株，通过形态学和分子生物学技术，结合柯赫氏法则对菌株进行鉴定，同时测试了8种药剂对病原菌生长及6种药剂对分生孢子萌發的影响。结果显示，引起山东省蓝莓叶斑病和根腐病的病原菌均为棒状拟盘多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）；苯醚甲环唑和福美双对P. clavispora菌丝生长的抑制效果最好，EC50均为1.97 mg/L，其次为苯甲·丙环唑，EC50为2.70 mg/L；福美双对分生孢子萌发的抑制效果最显著，EC50为0.004 mg/L，其次为苯醚甲环唑和戊唑醇；甲基硫菌灵对该菌几乎没有抑制作用。
关键词：棒状拟盘多毛孢；蓝莓；杀菌剂；抑菌效果
中图分类号：S436.639 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）09-0115-04
Abstract In order to clarify the pathogens and screen out the effective fungicides for blueberry leaf spot and root rot diseases in Shandong Province， the strains were obtained using tissue isolation method and identified based on morphological， molecular biology techniques and Koch’ s Rule. The inhibitory effects of 8 kinds of fungicides on mycelia growth and 6 kinds of fungicides on spore germination were determined. The results showed that the pathogen of blueberry leaf spot and root rot diseases in Shandong Province was Pestalotiopsis clavispora. Difenoconazole and thiram had the best inhibition on mycelia growth，and both the EC50 were 1.97 mg/L， followed by difenoconazole·propiconazole with the EC50 as 2.70 mg/L. The thiram had the best inhibition on conidia germination and the EC50 was 0.004 mg/L， followed by difenoconazole and tebuconazole. However， thiophanate-methyl had almost no inhibition effects on the pathogen.
Keywords Pestalotiopsis clavispora； Blueberry； Fungicides； Inhibitory effect
蓝莓（Vaccinium spp.）为杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）多年生小灌木浆果类果树，具有很好的营养保健作用[1]，1983年引入我国并进行栽培研究[2]。山东半岛地区因气候和土壤适合蓝莓生长，青岛胶南、威海乳山、日照五莲等地先后建立蓝莓生产基地，促进了山东半岛地区蓝莓产业的快速发展[3]。近年来，随着我国蓝莓栽培面积的不断扩大，病害也随之传播蔓延并逐年加重，成为制约蓝莓产业健康发展的主要限制因素[4-6]。
2016年和2017年8—9月，山东半岛蓝莓种植基地苗圃内叶斑病和根腐病大发生，造成大量苗木死亡。为明确蓝莓两种病害的病原菌种类及不同药剂对病原菌室内抑菌效果，本研究通过形态学和分子生物学技术确定病原菌种类，并通过菌丝生长速率法和孢子萌发法对多种杀菌剂进行室内筛选，以期为蓝莓叶斑病和根腐病有效防控提供参考依据。1 材料与方法
1.1 试验材料
供试病样及植物：2016年和2017年8—9月在山东半岛蓝莓种植基地采集发病蓝莓植株，带回实验室进行病原菌分离。供试蓝莓品种为公爵（cv. Duke）。
供试药剂：根据生产上常用杀菌剂，选取其中8种为供试药剂（表1）。
1.2 试验方法
1.2.1 蓝莓叶斑病和根腐病病原菌鉴定 从发病蓝莓叶片和根部取样，采用组织分离法进行病原菌的分离和纯化，分别获得3个菌株，保存于青岛农业大学果树病害流行与综合防控实验室。25℃恒温暗培养，定期观察菌落生长情况及产孢特征，根据形态学初步鉴定病菌。提取真菌基因组DNA[7]，利用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增。PCR反应体系（25 μL）：2 × TSINGKE Master Mix 12.5 μL，ITS1/ITS4（10 μmol/L）各1 μL，DNA 1 μL，超纯水补至25 μL。PCR反应条件：94℃ 3 min；94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 40 s，共35个循环；72℃ 10 min。经凝胶电泳检测后，交由青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，将获得的序列在NCBI数据库中进行BLAST比对分析并对病原菌进行鉴定。最后根据科赫氏法则回接健康蓝莓叶片和根部验证病原的致病性。
1.2.2 菌丝生长抑制试验 采用生长速率法[8]，测试8种杀菌剂对病菌的毒力。在无菌条件下，用无菌水将8种杀菌剂分别配成不同浓度梯度的药液，将49 mL PDA融化并冷却至45℃左右，每瓶PDA加入1 mL药液，充分摇匀，制成最终浓度（表1）的含药PDA，等量倒入直径为5.5 cm 的培养皿中，用5 mm打孔器在活化好的菌落边缘打取菌饼，接种于含不同药剂浓度PDA平板中央，置于25℃恒温暗培养，以不含药剂的无菌水处理作空白对照，每处理重复3次。3 d后用十字交叉法测量菌落直径，计算毒力回归方程。
菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径） × 100 。
1.2.3 孢子萌发抑制试验 通过孢子萌发试验[8]，测试6种杀菌剂对分生孢子萌发的影响。配置分生孢子悬浮液浓度至1.0×106个/mL，分別吸取孢子悬浮液和表1中不同浓度杀菌剂溶液的两倍液各50 μL，滴于洁净的单凹载玻片上，置于25℃恒温培养箱中培养，以无菌水为对照，每处理重复3次。12 h后在显微镜下观察，统计各处理三个视野中的分生孢子萌发率，并计算毒力回归方程。
孢子萌发率（%）=萌发孢子量/总孢子量×100 ；
孢子萌发抑制率（%）=（1-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率×100 。
2 结果与分析
2.1 蓝莓叶斑病和根腐病病原菌鉴定
从典型症状的蓝莓病叶和病根上通过组织分离法分别获得3个菌株，菌落均为圆形，呈白色绒毛状，菌落正面未有明显色素产生，背面呈淡黄色；培养3 d 时，菌落上开始形成黑色分生孢子盘，随后溢出分生孢子角，培养7 d时，可见大量的分生孢子盘和分生孢子角；成熟分生孢子呈纺锤形，由5个细胞组成，顶端具有2 ～ 4根透明附属丝，基部1根附属丝，3个中间细胞为橄榄色，比末端细胞颜色深。根据菌落和分生孢子形态特征，初步鉴定该病原菌为棒状拟盘多毛孢菌。通过对菌株ITS序列进行PCR扩增和凝胶电泳检测，均获得约600 bp的目标片段（图1）。纯化PCR后分别进行测序，序列分析结果显示两种病菌菌株的ITS序列完全一致，说明为同一种真菌，在NCBI数据库进行BLAST同源性比对，与不同来源棒状拟盘多毛孢的同源性均在99%以上。结合形态学鉴定结果，将蓝莓叶斑病和根腐病病原菌鉴定为棒状拟盘多毛孢。将菌株回接后，两者均发病，且发病症状与田间一致，后期产生分生孢子盘和分生孢子，再次组织分离和进行挑单孢，均获得相同菌株。
2.2 化学药剂筛选
8种化学药剂对病原菌均有不同程度的抑制作用，且随药剂浓度升高抑制作用逐渐增强（图2）。表2结果显示，三唑类杀菌剂苯醚甲环唑和有机硫类杀菌剂福美双对病原菌的抑制效果最明显，EC50均为1.97 mg/L；其次为三唑类杀菌剂苯甲·丙环唑和二甲酰亚胺类杀菌剂异菌脲，EC50分别为2.70 mg/L和5.63 mg/L；抑菌效果最差的为苯并咪唑类杀菌剂甲基硫菌灵，其EC50高达334 146.81 mg/L。
2.3 孢子萌发试验
6种杀菌剂对孢子萌发均有一定的抑制效果，且随着浓度增加分生孢子萌发率降低。表3结果显示，有机硫类杀菌剂福美双和三唑类杀菌剂苯醚甲环唑对分生孢子萌发的抑制效果最明显，EC50分别为0.004 mg/L和0.088 mg/L；其次为三唑类杀菌剂戊唑醇，EC50为1.824 mg/L；抑菌效果最差的为苯并咪唑类杀菌剂甲基硫菌灵，EC50高达34 283.529 mg/L。
3 讨论与结论
通过形态学特征、rDNA-ITS序列分析并结合致病性测定，将引起山东省蓝莓叶斑病和根腐病的病原菌鉴定为棒状拟盘多毛孢。已有研究表明，拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）真菌在自然界中广泛存在，种类繁多，多数种可引起植物病害，造成严重的经济损失[9]。其中，棒状拟盘多毛孢为多种作物叶斑病及根腐病病原菌[10，11]，也可以侵染蓝莓引起病害，国外报道该病菌可以引起枝条溃疡和枝枯病[12，13]，在国内可引起枝枯病[14，15]等。本研究证实棒状拟盘多毛孢是引致蓝莓叶斑病和根腐病的病原菌，并首次对该菌进行药剂筛选。
虽然棒状拟盘多毛孢菌可引起较为严重的病害，但针对该病原菌有效化学药剂筛选的研究较少，尤其在蓝莓病害上的药剂筛选未见报道。本研究通过测定不同杀菌剂对棒状拟盘多毛孢的抑制效果，筛选出了高毒力杀菌剂。三唑类杀菌剂苯醚甲环唑和有机硫类杀菌剂福美双对棒状拟盘多毛孢的菌丝生长抑制效果最好，同时对分生孢子萌发抑制效果也最好；苯并咪唑类杀菌剂甲基硫菌灵在生产上广泛使用，但对蓝莓棒状拟盘多毛孢的菌丝生长和孢子萌发几乎没有抑制作用。其它不同类型杀菌剂的抑制效果、所筛选药剂对蓝莓叶斑病和根腐病的田间防效及其持效期还有待进一步测试。值得注意的是，化学药剂过量使用会造成农药残留超标、影响食品安全、破坏生态环境等，因此，现代农业生产有害生物的防控需综合应用各项防治措施并结合精准防控技术，从而降低化学农药的使用量。
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